浅议流行病学黑龙江地区野生鸟类禽流感分子流行病学调查

论文导读：、N5。由此,2003-2010年黑龙江地区7年的流感监测结果表明,H6和H3为黑龙江地区的优势HA亚型,N1和N2为黑龙江地区的优势NA亚型,它们分别占黑龙江地区病毒分离总数58株(已确定亚型)的22.4138%、15.2542%和41.3793%、25.8621%。通过对黑龙江地区野生鸟类进行长达7年的禽流感流行病学调查,首次在中国大陆对野生鸟类进行了长期系统
摘要：禽流行性感冒,简称禽流感(Avian Influenza, AI),也称真性鸡瘟,是由A型流感病毒引发的主要以感染禽类为主的传染病。国际兽医局(OIE)将高致病性禽流感定为A类传染病,中国农业部将其列为甲类监测传染病,并被列入国际生物武器公约动物传染病名单。野生鸟类是禽流感病毒(AIV)的天然宿主,在野生鸟类中可以分离到禽流感病毒的所有16个HA亚型和9个NA亚型。随着候鸟的迁徙,带毒候鸟可能会将禽流感病毒传播到世界各地,由此,通过对野生鸟类进行禽流感的分子流行病学监测,对禽流感早期预警具有重要的指示作用。本论文于2003年2月至2010年4月对黑龙江及其他部分地区的野生鸟类进行了禽流感的分子流行病学调查,一方面调查了这些地区野生鸟类中禽流感病毒的分布情况,另一方面选取了有代表性的毒株进行了基因克隆和序列的分子遗传特点浅析。一、黑龙江地区野生鸟类禽流感的流行学调查2003年2月至2010年4月在黑龙江及其他部分地区的湿地、森林、农田和城市采集了1848份样品,其中野鸟样品1823份,包括11个目、32个科、78个属、129种,家鸭样品19份,环境水样5份,狮子样品1份。通过SPF鸡胚宿主系统进行禽流感病毒的分离,盲传三代后利用血凝试验进行AIV的初步检测,最后用RT-PCR策略进行病毒的鉴定,结果有53份样品经PCR反应呈AIV阳性,病毒分离率为2.8680%(53/1848)；利用血凝抑制试验(HI)和神经氨酸酶抑制试验(NI)并结合RT-PCR策略对53份AIV阳性样品进行病毒亚型的鉴定,结果以53份AIV阳性样品鉴定出59株AIV(2009年春季龙凤地区的3份样品为H4/H5/H13/N1/N2的混合感染)。病毒分离结果显示,不同生境类型样品的病毒分离率不同,在湿地采集样品的病毒分离率较高；不同宿主类型样品的病毒分离率不同,雁鸭类样品的病毒分离率较高；不同年龄野鸭病毒分离率不同,幼龄鸭病毒分离率较高；不同采样时间病毒分离率不同,秋季病毒分离率较高；不同采样部位病毒分离率不同,棉拭子样品病毒分离率较高。58株AIV的亚型鉴定结果显示(1株AIV没鉴定出亚型),HA亚型包括2株H1、4株H2、9株H3、7株H4、8株H5、13株H6、3株H7、8株H11、4株H13,没有分离到H8. H9、H10、H12、H14、H15、H16; NA亚型包括24株N1、15株N2、7株N6、2株N7、8株N8、2株N9,没有分离到N3、N4、N5。由此,2003-2010年黑龙江地区7年的流感监测结果表明,H6和H3为黑龙江地区的优势HA亚型,N1和N2为黑龙江地区的优势NA亚型,它们分别占黑龙江地区病毒分离总数58株(已确定亚型)的22.4138%、15.2542%和41.3793%、25.8621%。通过对黑龙江地区野生鸟类进行长达7年的禽流感流行病学调查,首次在中国大陆对野生鸟类进行了长期系统的流感监测,同时我们还建立了一个中国大陆亚型最丰富的野鸟源禽流感病毒的保存库。二、代表性分离株的基因克隆及序列浅析为了了解黑龙江地区野生鸟类中禽流感病毒基因的进化和遗传变异情况以及与家禽流感和人流感的相关性,我们以本探讨分离的59株病毒中选取了有代表性的毒株的基因进行克隆和测序,结果共成功获得210条基因序列,其中36条HA、31条NA、25条PB2、23条PB1、24条PA、23条NP、24条M、24条NS。各病毒基因的同源性比较和遗传进化浅析结果显示,黑龙江地区的野生鸟类是一个复杂的禽流感病毒的基因库,不同亚型的病毒之间以及亚型相同的不同病毒之间的相应基因都有着不同的进化来源,经总结归纳得出如下结论：1、克隆得到的36株病毒的血凝素蛋白裂解位点以及其他关键位点的比较浅析,可以看出只有2株分离株LK/HB/194/07(H5N1)和L/China/Z-1/08(H5N1)符合高致病性禽流感的典型分子特点,由此黑龙江地区野生鸟类携带的主要以低致病性禽流感为主。2、外部基因的同源性比较和遗传进化浅析结果显示,黑龙江地区野生鸟类中不同亚型流感病毒的HA和NA之间有着着广泛的基因重排现象。3、部分外部基因(H2、H6、N1、N6)在北美大陆和欧亚大陆之间有着禽流感病毒基因的交流,说明候鸟可以携带部分低致病性禽流感做长距离迁徙,日本和阿拉斯加可能就是流感病毒在欧亚和北美大陆之间进行传播和基因交流的首要站点。4、内部基因的同源性比较和遗传进化浅析结果显示,黑龙江地区野生鸟类中禽流感病毒的内部基因来源复杂多样,并且在北美大陆和欧亚大陆之间禽流感病毒的内部基因有着着广泛的和普遍的基因交流。5、尽管不同亚型的病毒之间以及亚型相同的不同病毒之间的相应基因都有着不同的进化来源,但是本探讨分离株的大多数基因与日本、韩国毒株的亲缘联系较近,说明在韩国、日本和中国之间流感病毒有着频繁的基因交流和交换。6、H4N6、H5N1、H7N1与其他分离株的进化来源不同,H4N6分离株起源于台湾早期毒株,同时还发现H4亚型流感病毒在黑龙江地区的家鸭和野鸭中有着着相互传播现象；H5N1分离株LK/HB/194/07(H5N1)和L/China/Z-1/08(H5N1)不同于广东96、香港97、青海湖等中国以往的代表株,而是起源于越南A/chicken/Vietnam/216/2005(H5N1)的一株新基因型病毒；H7N1分离株BP/HN/414/10(H7N1)起源于欧洲(捷克或斯洛文尼亚),同时发现不同时间、不同地点、不同宿主的H7亚型流感病毒受体结合位点是十分保守的。7、分离株CS/SJ/355/07(H11N8)的H11基因单独形成一个聚群,与其它参考毒株的同源性均不是很高,最高为duck/England/56(H11N6)(95%),并且分离株与猪流感病毒swine/KU/2/01(H11N6)同源性较高(94.9%),同时,血凝素受体结合位点为133V和222R,与猪源毒株一致,说明分离株CS/SJ/355/07(H11N8)有可能是最新变异论文导读：洲流感(H2N2)18-191.2.31968-1969年的香港流感(H3N2)191.2.41977-1978年的俄国流感(H1N1)19-201.2.51997年香港H5N1流感201.2.62003-2004年亚洲H5N1流感20-211.2.72005年青海湖候鸟H5N1流感211.2.82009年全球甲型H1N1流感21-221.3禽流感的病原学22-241.

3.1禽流感病毒的分类地位221.2禽流感病毒的命名22-231.3禽

产生的一个新毒株,并有可能对猪等哺乳动物具有易感性,以而引发新的流行。8、同源性比较及遗传进化浅析结果显示,分离株G/SJ/160/06(H5N2)是韩国猪流感swine/Korea/C13/2008(H5N2)的供体毒株。9、通过基因的核苷酸和氨基酸多序列比对,发现了在血凝素蛋白裂解位点、受体结合位点以及其他基因中与毒株的宿主范围和地域分布相关的几个关键位点。10、首次在中国大陆的野生鸟类中分离到H4N6、H7亚型流感病毒,并成功获得其病毒的全序列。11、建立了中国大陆基因型最丰富的野鸟源禽流感病毒的基因库。关键词：野生鸟类论文禽流感论文分子流行病学论文遗传进化浅析论文
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Abstract6-17
1 绪论17-36

1.1 引言17

1.2 禽流感的历史17-22

1.2.1 1918-1919年的西班牙流感(H1N1)17-18

1.2.2 1957-1958年的亚洲流感(H2N2)18-19

1.2.3 1968-1969年的香港流感(H3N2)19

1.2.4 1977-1978年的俄国流感(H1N1)19-20

1.2.5 1997年香港H5N1流感20

1.2.6 2003-2004年亚洲H5N1流感20-21

1.2.7 2005年青海湖候鸟H5N1流感21

1.2.8 2009年全球甲型H1N1流感21-22

1.3 禽流感的病原学22-24

1.3.1 禽流感病毒的分类地位22

1.3.2 禽流感病毒的命名22-23

1.3.3 禽流感病毒的形态特点23

1.3.4 禽流感病毒的培养特性23

1.3.5 禽流感病毒的血凝活性23-24

1.3.6 禽流感病毒的抗原性变异24

1.4 禽流感病毒基因及其蛋白24-28

1.4.1 聚合酶蛋白PB2及其基因25

1.4.2 聚合酶蛋白PB1及其基因25

1.4.3 聚合酶蛋白PA及其基因25-26

1.4.4 血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白及其基因26

1.4.5 核衣壳蛋白(Nucleoprotein,NP)及其基因26-27

1.4.6 神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)及其基因27

1.4.7 基质蛋白(Matrix Proteins,M)及其基因27

1.4.8 非结构蛋白(Nonstructural Proteins,NS)及其基因27-28

1.5 流行病学28-29

1.5.1 传染源28

1.5.2 传播途径28

1.5.3 易感动物28-29

1.6 全球野生鸟类禽流感的监测情况29-34

1.6.1 北美地区29-32

1.6.2 欧洲地区32-33

1.6.3 亚洲地区33-34

1.6.4 大洋洲地区34

1.6.5 非洲地区34

1.7 本探讨目的作用34-36

2 实验1 黑龙江地区野生鸟类禽流感的流行学调查36-49

2.1 实验材料和实验仪器36-38

2.

1.1 实验样品36-37

2.

1.2 实验仪器37

2.

1.3 实验试剂37

2.

1.4 SPF鸡胚及SPF鸡红细胞37-38

2.2 实验策略38-40

2.1 样品采集38

2.2 样品处理38

2.3 病毒分离38

2.4 血凝实验38-39

2.5 RT-PCR实验39-40

2.6 AIV血凝素亚型及神经氨酸酶亚型的鉴定40

2.3 实验结果40-44

2.3.1 病毒分离结果40-42

2.3.2 病毒亚型鉴定结果42-43

2.3.3 HA和NA亚型分布43-44

2.4 讨论44-49

2.4.1 不同采样地区的病毒分离率不同44-45

2.4.2 不同生境类型样品的病毒分离率不同,在湿地采集样品的病毒分离率最高45

2.4.3 不同宿主类型样品的病毒分离率不同,雁鸭类样品的病毒分离率较高45-46

2.4.4 不同年龄野鸭病毒分离率不同,幼龄鸭病毒分离率较高46

2.4.5 不同采样时间病毒分离率不同,秋季病毒分离率较高46-47

2.4.6 不同采样部位病毒分离率不同,棉拭子样品病毒分离率较高47

2.4.7 黑龙江地区流感病毒的优势亚型47-49

3 实验2 代表性分离株的基因克隆及序列浅析49-145

3.1 实验材料和实验仪器49-50

3.

1.1 实验样品49

3.

1.2 实验仪器49-50

3.

1.3 实验试剂50

3.2 实验策略50-53
3.

2.1 RT-PCR实验50

3.

2.2 PCR产物回收和纯化50-51

3.

2.3 PCR回收产物鉴定51

3.

2.4 连接51

3.

2.5 转化51-52

3.

2.6 质粒提取52

3.

2.7 重组质粒鉴定52-53

3.

2.8 序列测定与浅析53

3.3 实验结果53-107

3.1 病毒基因测序结果53-54

3.2 同源性比较结果54-75

3.3 进化树75-95

3.4 血凝素蛋白裂解位点95

3.5 糖基化位点浅析95-105

3.6 受体结合位点105-107

3.4 讨论107-145

3.4.1 H1基因的分子遗传浅析107-109

3.4.2 H2基因的分子遗传浅析109-111

3.4.3 H3基因的分子遗传浅析111-113

3.4.4 H4基因的分子遗传浅析113-115

3.4.5 H5基因的分子遗传浅析115-119

3.4.6 H6基因的分子遗传浅析119-121

3.4.7 H7基因的分子遗传浅析121-123

3.4.8 H11基因的分子遗传浅析123-125

3.4.9 N1基因的分子遗传浅析125-128

3.4.10 N2基因的分子遗传浅析128-129

3.4.11 N6基因的分子遗传浅析129-131

3.4.12 N7基因的分子遗传浅析131-132

3.4.13 N8基因的分子遗传浅析132-135

3.4.14 N9基因的分子遗传浅析135-136

3.4.15 PB2基因的分子遗传浅析136-137

3.4.16 PB1基因的分子遗传论文导读：分子遗传浅析141-1423.4.20NS基因的分子遗传浅析142-145结论145-147参考文献147-159附录A样品采集表159-177附录B鸟类样品种类统计表177-181附录C英文缩写对照表181-182攻读学位期间发表的学术论文182-183致谢183-184上一页123
浅析137-139

3.4.17 PA基因的分子遗传浅析139-140

3.4.18 NP基因的分子遗传浅析140-141

3.4.19 M基因的分子遗传浅析141-142

3.4.20 NS基因的分子遗传浅析142-145

结论145-147
参考文献147-159
附录A 样品采集表159-177
附录B 鸟类样品种类统计表177-181
附录C 英文缩写对照表181-182
攻读学位期间发表的学术论文182-183
致谢183-184