简析肠源性内毒素血症在NAFLD、T2DM发病中作用及其分子机制-

论文导读：
摘要：近些年来随着饮食生活方式的转变,以脂肪、糖类(蔗糖或果糖)为代表的高热量食物和饮料所占比例显著增加,超重与肥胖者日益增加,脂肪肝、Ⅱ型糖尿病(type2diabetes melptus, T2DM)、高血压及心脑血管疾病等代谢性疾病的发病率呈逐年增高的走势,而非洒精性脂肪性肝病(nonalcohopc fatty pver disease, NAFLD)作为代谢综合征(metabopc syndrome, MS)在肝脏的体现也愈加受到重视。现已证实NAFLD大多伴有肠源性内毒素血症(Intestinal endotoxemia, IETM)。我们实验证实皮下小剂量注射LPS第9周可使大鼠发生胰岛素抵抗(insupn resistance, IR)和非酒精性脂肪性肝炎(nonalcohopc steatohepatitis, NASH),结合Cani运用高脂膳食可引起代谢性内毒素血症,并可诱发肥胖与胰岛素抵抗,使我们联想IETM是否既可引起慢性低度炎症又可引发以IR为基础的代谢综合征,在NAFLD、T2DM等代谢综合征相关疾病的发生进展中可能发挥着启动作用,由此设计以下实验来证实我们的观点。本论文共分三部分：第一部分代谢综合征及其相关疾病动物模型的建立第二部分IETM在MS及相关疾病发生进展中的作用的探讨第三部分IETM启动MS相关代谢疾病的基本机制第一部分通过长期高糖高脂饮食建立代谢综合征及其相关疾病的动物模型实验一大鼠体重及内脏脂肪重量的转变选取64只雄性SD大鼠适应性饲养1周后,随机分为8组：3月正常对照组8只(3C),6月正常对照组8只(6C),9月正常对照组8只(9C),12月正常对照组8只(12C),以正常饮食喂养；3月高糖高脂组(3H)8只,6月高糖高脂组(6H)8只,9月高糖高脂组(9H)8只,12月高糖高脂组(12H)8只,采取高糖高脂膳食(70%正常饲料+20%猪油+10%蔗糖+1%胆固醇十0.25%胆酸)喂养。上面陈述的各组动物均在天黑前投食,自由饮水,每月称体重一次。分别于实验第3月末、第6月末、第9月末、第12月末于大鼠麻醉状态下,称取体重；量取体长,计算Lee's指数；并于无菌条件下摘取肝脏、内脏脂肪组织(附睾和肾周)称重,计算肝脏、内脏脂肪与杀鼠前大鼠重量比值。结果：经高糖高脂膳食喂养后,各阶段模型组大鼠与正常组大鼠相比,体重、Lee's index显著增加(p0.05)；肝指数、内脏脂肪占体重百分比显著增加(p0.05)。提示经过高糖高脂饮食喂养可诱发大鼠发生超重和肥胖。实验二大鼠血浆炎症介质的变化上面陈述的动物于实验第3月末、第6月末、第9月末、第12月末观察血液LPS、TNFa、CRP的转变。结果：经高糖高脂喂养一年的大鼠各阶段血浆LPS、TNFa、CRP水平显著高于正常对照组(P0.05),提示经高糖高脂喂养大鼠在第3个月时已形成肠源性内毒素血症和低度炎症,且持续增高至第12个月。实验三大鼠血脂及肝酶的转变上面陈述的动物于实验第3月末、第6月末、第9月末、第12月末观察血液TG、Tch、HDL-c、 LDL-c和ALT的转变。结果：经一年高糖高脂喂养模型组大鼠于实验第三月末已出现高甘油三酯血症、高胆固醇血症、异常脂蛋白血症；肝酶ALT活性显著升高。实验四FPG、FIN、HOMA-IR、HOMA-β及大鼠糖耐量的转变上面陈述的动物于实验第2月末进行腹腔糖耐量,并于实验第3月末、第6月末、第9月末、第12月末观察血液FPG、FINS、HOMA-IR和HOMA-β的转变。结果：大鼠糖耐量显著降低；FPG、FINS和HOMA-IR的水平都升高,其差别有统计学作用；而HOMA-p以第六个月出现代偿性增强后进行性衰退。糖耐量实验的五次采血均显示高糖高脂组的血糖水平显著高于正常对照组,表明大鼠糖耐量显著降低。实验五肝脏、胰腺及脂肪组织的病理转变及肝细胞、胰岛β细胞凋亡的观察上面陈述的动物分别于实验第3月末、第6月末、第9月末、第12月末于大鼠麻醉状态下,摘取肝脏、胰腺和内脏脂肪组织固定于10%中性溶液,石蜡包埋切片,进行HE染色,光镜下观察病理学转变。运用TUNEL进行肝细胞、胰岛β细胞凋亡的观察。结果：病理组织学显示肝脏发生严重的脂变、脂肪肝进而发生肝炎、纤维化及肝硬化；随时间进展胰岛逐渐萎缩并伴有炎性浸润；脂肪细胞逐渐增大并伴有炎性浸润。TUNEL结果显示高糖高脂组3-12月见到肝细胞、胰岛凋亡细胞数量逐渐增加,与正常对照组相比有显著性差别。综合第一部分的实验结果归纳如下：①高糖高脂喂养一年大鼠出现了肥胖和内脏脂肪的增加,异常脂蛋白血症,糖耐量减低和空腹血糖升高等代谢综合征的主要组份；②高糖高脂喂养一年大鼠肝脏发生严重的脂变、脂肪肝进而发生肝炎、纤维化及肝硬化,符合NAFLD的整个历程；③高糖高脂喂养一年早期大鼠出现IR,后期病理观察胰岛萎缩,TUNEL证实胰岛细胞数量逐渐减少导致分泌功能进行性下降最终衰竭走向显性T2DM。④非酒精性脂肪性肝病与II型糖尿病都属于MS相关的疾病,这一组疾病其本质是慢性低度炎症性疾病,其共同的基本发病机制是胰岛素抵抗,高糖高脂喂养一年大鼠出现慢性低度炎症,并且胰岛素抵抗指数显著增加并且始终保持高水平。⑤虽然整个实验时间过长,但符合临床实际,可通过渐进历程深入了解其病理历程,是探讨代谢综合征及其相关疾病的成功的动物模型。第二部分IETM在MS及相关疾病(NAFLD与T2DM)发生进展中的作用的探讨实验六IETM诱发慢性低度炎症上面陈述的动物于实验第3月末、第6月末、第9月末、第12月末观察血液MCP-1的水平,免疫组化策略检测内脏脂肪组织、肝组织、胰腺组织中CD68的表达情况。结果：经高糖高脂喂养一年的大鼠各阶段血浆MCP-1水平显著高于正常对照组(P0.05),且持续增高至第12个月。免疫组化结果显示各阶段高糖高脂组大鼠的脂肪组织、肝组织、胰腺组织CD68表达水平显著升高,且随时间推移加重。实验七IETM与胰岛素抵抗检测各阶段大鼠肝脏T论文导读：酒精性脂肪性肝病有着肠源性内毒素血症,并且一直延续至T2DM的出现。②ETM可以诱发慢性低度炎症反应。③ETM通过脂解作用推动肝、胰的异位脂质沉积,影响并决定着IR的发生。第三部分IETM启动MS相关代谢疾病的基本机制实验九氧化应激检测各阶段大鼠血浆SOD、MDA的水平,并观察肝脏、胰腺ROS的转变。结果：大鼠血浆SOD水平显著降低
G含量,并对肝脏TG与IR, LPS与IR进行相关性浅析。结果：各阶段肝TG含量显著升高,并且肝TG与IR, LPS与IR呈显著正相关。实验八脂质异地沉积检测各阶段大鼠血浆FFA的含量,并对肝脏、胰腺进行苏丹IV染色观察脂肪沉积情况。结果：经一年高糖高脂喂养模型组大鼠于实验第三月末FFA水平已显著升高,至第六个月达到高峰并持续升高至第十二个月,肝脏、胰腺组织可见程度不等的脂肪沉积。综合第二部分的实验结果,归纳如下：①高糖高脂诱导的非酒精性脂肪性肝病有着肠源性内毒素血症,并且一直延续至T2DM的出现。②ETM可以诱发慢性低度炎症反应。③ETM通过脂解作用推动肝、胰的异位脂质沉积,影响并决定着IR的发生。第三部分IETM启动MS相关代谢疾病的基本机制实验九氧化应激检测各阶段大鼠血浆SOD、MDA的水平,并观察肝脏、胰腺ROS的转变。结果：大鼠血浆SOD水平显著降低,而MDA水平显著升高,且LPS与SOD呈负相关,LPS与MDA呈正相关；肝脏的ROS含量于实验第三个月开始升高,而胰腺的ROS含量于实验第六个月开始升高,并且持续升高至实验第十二个月,这些结果提示氧化应激的有着。实验十内质网应激采取Western blotting测定用组织、胰腺组织中JNK1、p-JNK1、NFκBp65、IκB、GRP78蛋白表达水平。结果：各阶段高糖高脂组的大鼠肝组织p-JNK1、NF-κBp65、GRP78表达显著高于正常组,而I-KB表达显著低于正常组；高糖高脂组的大鼠胰腺组织p-JNKl、 NF-κBP65的表达于第六个月开始升高,第九个月、第十二个月达到高峰,而I-κB的表达也于第六个月开始降低。模型组GRP78的表达自第三个月开始增强,于第九个月升至最高且持续至第十二个月保持较高水平,与对照组差别显著。这些结果提示肝脏、胰腺均发生了内质网应激。综合第三部分的实验结果,归纳如下：①模型组大鼠血浆中MDA水平增加而抗氧化酶SOD的水平减少,并且MDA的转变与LPS呈显著正相关,SOD的转变与LPS呈显著负相关；同时肝脏和胰腺的ROS水平有不同程度的增加,进一步支持LPS可通过诱发氧化应激参与NAFLD、T2DM等MS相关疾病的发生进展。②血中LPS升高水平与肝脏、胰岛P-JNK、NF-κB和GRP78走向大体一致,LPS可能通过肝脏和胰岛浸润的单核巨噬细胞,诱发内质网应激,使GRP78以跨膜蛋白脱落入血,使p-JNK和NF-κB信号蛋白表达增加。综上所述,本探讨得出以下结论：1.高糖高脂膳食喂养大鼠可以成功复制和人类临床实际更为接近的代谢综合征及其相关疾病的模型。2.高糖高脂所致的非酒精性脂肪性肝病伴有肠源性内毒素血症,并且一直延续达一年之久。3.IETM可以诱发慢性低度炎症与胰岛素抵抗,并可以通过脂解作用引起脂质异地沉积,使肝细胞蓄积大量TG、炎症并伴有纤维化；使胰岛p细胞发生IR、炎症、胰岛素分泌减少和胰岛β细胞凋亡发生。4.LPS所致的氧化应激与内质网应激可能是启动NAFLD与T2DM发生的基本机制。关键词：肠源性内毒素血症论文代谢综合征论文非酒精性脂肪性肝病论文Ⅱ型糖尿病论文氧化应激论文内质网应激论文
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Abstract10-15
前言15-18
参考文献17-18
第一部分 代谢综合征及其相关疾病动物模型的建立18-43
实验

一、大鼠体重及内脏脂肪重量的转变18-21

材料与方18-19
结果19-21
实验

二、大鼠炎症介质的转变21-24

材料与策略21-22
结果22-24
实验

三、大鼠血脂及肝酶的转变24-26

材料与策略24
结果24-26
实验

四、FPG、FIN、HOMA-IR、HOMA-β及大鼠糖耐量的转变26-30

材料与策略26-27
结果27-30
实验

五、肝脏、胰腺及脂肪组织的病理转变及肝细胞、胰岛β细胞凋亡的观察30-40

材料与策略30-31
结果31-40
讨论40-42
参考文献42-43
第二部分 IETM在MS相关的NAFLD与Ⅱ型糖尿病发病中的作用43-74
实验

六、IETM诱发慢性低度炎症反应43-51

材料与策略43-44
结果44-51
实验

七、IETM与胰岛素抵抗51-54

材料与策略51-52
结果52-54
实验八 脂质异地沉积54-58
材料与策略54-55
结果55-58
讨论58-67
参考文献67-74
第三部分 IETM启动MS相关疾病的基本机制74-99
实验九氧化应激74-82
材料与策略74
结果74-82
实验十 内质网应激82-90
材料与策略82-84
结果84-90
讨论90-95
参考文献95-99
结论99-100
综述 肠源性内毒素血症与代谢综合征及其相关疾病100-117
参考文献110-117
中英文縮略词表117-119
个人介绍119-120
致谢120